疫苗的mRNA遞送系統(tǒng)性能的決定性因素

mRNA遞送系統(tǒng)的性能決定因素是多因素且相互作用的，包括：(1)它們向靶細(xì)胞遞送的能力，并將mRNA有效地釋放至細(xì)胞質(zhì)并進(jìn)行翻譯的效率；(2)佐劑，可以增強(qiáng)免疫反應(yīng)；(3)將注射部位或全身分布的過度炎癥和脫靶表達(dá)可能引起的不良反應(yīng)或毒性降至低。

劑量

目前在SARS-CoV-2臨床試驗(yàn)中追求的大劑量范圍給藥（從1 µg到100 µg），能夠評價mRNA遞送系統(tǒng)的效率(表1)。臨床試驗(yàn)中的劑量主要分為較高劑量（30-100 µg）的核苷修飾RNA(Moderna，BioNTech)，較低劑量（7.5-20 µg）的未修飾的RNA(CureVac，Translate Bio)，甚至更低劑量（1-10 µg）的自擴(kuò)增RNA(Arcturus，倫敦帝國理工學(xué)院)。

決定這些劑量的因素有兩個：與恢復(fù)期血漿相比，中和抗體效價和T細(xì)胞反應(yīng)水平，以及在每個劑量下發(fā)生不良反應(yīng)的頻率和嚴(yán)重程度。第一階段臨床試驗(yàn)中所有高劑量實(shí)驗(yàn)的中止就證明了SARS-CoV-2疫苗有一個相當(dāng)狹窄的接受窗口，達(dá)到保護(hù)所需的劑量產(chǎn)生了難以接受的不良反應(yīng)的頻率和嚴(yán)重程度。在BioNTech第一階段臨床試驗(yàn)中測試的兩種核苷修飾的RNA與恢復(fù)期血漿相比，具有較高的中和效價，而由于編碼膜結(jié)合的全長刺突蛋白的較大結(jié)構(gòu)RNA發(fā)生不良反應(yīng)的頻率和嚴(yán)重程度較低，因此進(jìn)行了第三階段臨床研究。值得注意的是，劑量以質(zhì)量表示，而摩爾劑量取決于結(jié)構(gòu)的長度，而且，根據(jù)遞送系統(tǒng)的效率和靶向特性，實(shí)際翻譯的mRNA量只是兩者中的一小部分。

在預(yù)防傳染病的mRNA疫苗的動物研究中，當(dāng)使用魚精蛋白、樹枝狀大分子和早期陽離子脂質(zhì)系統(tǒng)時，在小鼠中能夠產(chǎn)生中和抗體或抵御病毒的初始劑量高達(dá)10-80 µg(表3)。當(dāng)之后使用*近的LNPs遞送的mRNA疫苗時，小鼠中和所需的劑量在給藥兩次時降低到接近1 µg，而對于未修飾的mRNA，所需劑量更低，接近0.25 µg。對于自我擴(kuò)增的mRNA，劑量可以更低，只需要兩次給藥0.1 µg或一次給藥2 µg。在較大的動物模型(倉鼠、雪貂和非人的靈長類動物)中，可用的研究較少，劑量范圍很廣，從5 µg到200 µg，沒有明顯的模式。

有趣的是，當(dāng)使用體表面積將人的劑量轉(zhuǎn)換為動物的劑量時，60 kg人的100 µg劑量相當(dāng)于3 kg獼猴的15 µg劑量和20 g小鼠的0.4 µg劑量，這兩個數(shù)據(jù)與表1和表3中的LNPs大致相同。顯然，給藥系統(tǒng)在確定有效劑量方面起著重要作用。人們強(qiáng)烈希望提高給藥效率，以減少劑量和維持效價，因?yàn)檫@有望通過減少mRNA和給藥載體的局部反應(yīng)和脫靶效應(yīng)來降低不良反應(yīng)的頻率和嚴(yán)重程度。減少劑量還將降低每個人接種疫苗所需的原材料數(shù)量和相關(guān)成本。特別是當(dāng)前的大流行使人們關(guān)注到mRNA LNP疫苗的一些重大供應(yīng)鏈和生產(chǎn)能力的限制，這一狀況可以通過更有效的遞送系統(tǒng)加以改善。

表3：體內(nèi)預(yù)防性接種的mRNA劑量。不同的mRNA傳遞系統(tǒng)和不同的物種顯示了誘導(dǎo)中和抗體效價或抵御病毒攻擊所需的mRNA的劑量。與早期的遞送系統(tǒng)相比，脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)遞送的mRNA的所需劑量減少了10倍。

效價和遞送效率

已經(jīng)有許多研究試圖確定LNP和其他核酸遞送系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)-功能的關(guān)系。決定其效價或傳遞效率的LNP*常用的參數(shù)是pKa。pKa是使LNP中50%的可電離脂質(zhì)質(zhì)子化時的pH。到目前為止，LNP的pKa通過一種叫TNS的染料來測定，TNS是帶負(fù)電荷的，當(dāng)與帶正電荷的LNP結(jié)合時，產(chǎn)生熒光增效果好果。

用TNS培養(yǎng)的LNPs在pH范圍較大的緩沖液內(nèi)進(jìn)行熒光測量，以推斷染料與表面電荷的結(jié)合，估算pKa，發(fā)現(xiàn)達(dá)到了大熒光的一半。基于MC3的Onpattro LNP在靜脈注射后使肝細(xì)胞沉默的佳pKa為6.4。TNS的pKa在6.2-6.8范圍內(nèi)對任何一種LNP都有一個肝細(xì)胞沉默的佳值。解釋這種依賴于pKa的原理是基于LNP的可電離脂質(zhì)在pH為7.4時接近中性，而在它進(jìn)入細(xì)胞后，內(nèi)涵體的pH值隨著內(nèi)涵體途徑的演變而開始下降，使可電離脂質(zhì)質(zhì)子化，而可電離脂質(zhì)又將結(jié)合到內(nèi)涵體的一個陰離子內(nèi)源性磷脂上并且破壞其雙層結(jié)構(gòu)，從而將mRNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中用于核糖體翻譯表達(dá)蛋白。

內(nèi)涵體逃逸需要可電離脂質(zhì)的另一個特征，即錐形的形態(tài)，其中脂質(zhì)尾部的橫截面大于其頭部。這使得可電離的脂質(zhì)/內(nèi)涵體磷脂離子對和雙層結(jié)構(gòu)不相容，并且更有可能形成倒六邊形的結(jié)構(gòu)，從而破壞內(nèi)涵體的膜結(jié)構(gòu)。這也被稱為分子形狀假說，它解釋了為什么在飽和的C18烷基鏈上引入一個或兩個雙鍵會產(chǎn)生更多的錐形和更少的圓柱形的形態(tài)，即膜的破壞和內(nèi)涵體逃逸。

這兩個C18亞油酸的尾部，與二甲胺頭部的適當(dāng)?shù)摹⒄{(diào)節(jié)好的pKa結(jié)合，是MC3可電離脂質(zhì)所定義的特征。取代MC3用于mRNA傳遞的可電離脂質(zhì)保留了pKa的要求，但通過在烷基尾部引入更多的支鏈來追求更大的內(nèi)涵體裂解特性。例如，來自Moderna的脂質(zhì)H和脂質(zhì)5和Arcturus的脂質(zhì)2，2(8，8)4C CH3一樣，有三個烷基尾部，而Acuitas的ALC-0315有四個烷基尾部，A9有五個烷基尾部(表2)。這種增強(qiáng)的錐形形態(tài)解釋了含有這些可電離脂質(zhì)的LNPs是更有效的遞送載體，具有更強(qiáng)的內(nèi)涵體逃逸。

雖然LNP的pKa和分子形狀假說對LNP的遞送效率有很好的貢獻(xiàn)，但其他因素也很重要，如LNP表面PEG-脂質(zhì)的穩(wěn)定性，以及四種脂質(zhì)在乙醇溶液中的比例，這些因素*終決定了LNP的超微結(jié)構(gòu)。如上所述，PEG-脂質(zhì)通過提供親水性外殼來控制LNP的大小，該外殼在組裝過程中限制囊泡融合，從而使較高的PEG-脂質(zhì)濃度產(chǎn)生較小的LNP。

如一項研究表明，將PEG-脂質(zhì)的摩爾分?jǐn)?shù)從0.25%改變到5%，可以將LNP的大小從117 nm減少到25 nm，而當(dāng)使用摩爾分?jǐn)?shù)為2.5%的PEG-脂質(zhì)時，肝細(xì)胞沉默的佳粒徑大小是78 nm。由于PEG-脂質(zhì)的烷基尾部有14個碳，它不能穩(wěn)定地固定在LNP表面，隨著可電離脂質(zhì)MC3和DSPC的脫落，它逐漸在循環(huán)中從LNP上脫落。這種PEG脫落被認(rèn)為在一定程度上使LNP轉(zhuǎn)染有效，但如果脫落過強(qiáng)，會導(dǎo)致可電離脂質(zhì)和DSPC的迅速喪失，這將對內(nèi)涵體逃逸產(chǎn)生不利的影響。

例如，通過將烷基尾部延伸到18個碳，PEG-脂質(zhì)不會脫落，但在肝細(xì)胞中也沒有被沉默。另一方面，加入較高濃度的PEG使顆粒變得更小，會導(dǎo)致更快的脫落、可電離脂質(zhì)丟失、并且減少沉默基因效果。目前，人們對LNP的不穩(wěn)定和動態(tài)性質(zhì)不*了解。另一項研究（與上面提到的研究類似）還發(fā)現(xiàn)，用1.5%的PEG-脂質(zhì)制備的中等直徑64 nm的LNP比更大直徑（100 nm）的LNP(0.5%PEG脂質(zhì))以及更小直徑（48 nm）LNP(3%PEG脂質(zhì))能更有效地遞送mRNA。

然而，通過改變四種脂質(zhì)的摩爾比，在1.5%PEG-脂質(zhì)、直徑64 nm的LNP中，以保持計算出的LNP PEG層下的DSPC密度為佳值，這樣能夠制備更大尺寸的的（100 nm）LNP，其mRNA表達(dá)與64 nm的LNP相比增加了兩倍。因此，除了LNP的pKa、可電離脂質(zhì)的分子形狀和PEG-脂質(zhì)的動力學(xué)之外，更詳細(xì)的LNP超微結(jié)構(gòu)特征和每個組分的狀態(tài)也決定了其效價。

內(nèi)涵體逃逸

對siRNA-LNPs的細(xì)胞攝取和內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行了詳細(xì)的研究，并假設(shè)其與mRNA LNPs的細(xì)胞攝取和內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)相似。一項使用電子顯微鏡中金溶膠粒子計數(shù)的定量研究表明，對于MC3 LNP，內(nèi)涵體中只有2%的siRNA從內(nèi)涵體逃逸到胞漿中，導(dǎo)致每個細(xì)胞中有幾千個siRNA分子可供沉默。

然而，這個數(shù)字與在**相關(guān)濃度下每個細(xì)胞RISC與有功能活性的siRNA的相互作用估計水平的范圍相同。因此，絕大多數(shù)siRNA注定要進(jìn)行溶酶體降解或通過多囊體(晚期內(nèi)涵體)循環(huán)在體外進(jìn)行釋放。增加LNPs的內(nèi)涵體逃逸是提高給藥效率的主要途徑，主要是通過調(diào)節(jié)LNP的pKa和增加可電離脂質(zhì)的錐形形態(tài)來實(shí)現(xiàn)的。

對于后者，脂質(zhì)H和脂質(zhì)5含有三個分支，而在MC3中只有兩個分支，但具有相似的PKA，與MC3相比，它們的內(nèi)涵體逃逸率變?yōu)樵瓉淼乃谋丁Ｄ壳斑€沒有報道Acuitas ALC-0315的內(nèi)涵體逃逸情況，但Acuitas ALC-0315的肝細(xì)胞沉默效率是MC3的10倍，這表明其更具有錐形的四分支結(jié)構(gòu)也有更強(qiáng)的內(nèi)涵體逃逸。

因此，這些新一代的可電離脂質(zhì)似乎實(shí)現(xiàn)了內(nèi)涵體逃逸率，與MC3 siRNA-LNPs的2-5%相比，接近15%或更高。這一領(lǐng)域的挑戰(zhàn)之一是缺乏可廣實(shí)施的可靠、標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)涵體逃逸方法。目前已經(jīng)開發(fā)了許多方法，但通常只針對一個實(shí)驗(yàn)室組。*近還發(fā)現(xiàn)，mRNA發(fā)生胞吐的量與釋放到胞漿中的量相似。MC3 LNPs在MC3的晚期內(nèi)涵體和NP1復(fù)合體中被解離，MC3LNPs和mRNA被重新包裹成外泌體，并從細(xì)胞中輸出。這些內(nèi)-外泌體與*初的MC3 LNPs具有相似的mRNA遞送能力，但內(nèi)-外泌體可以運(yùn)輸?shù)讲煌慕M織，且似乎免疫**能力較低。LNPs攜帶的mRNA的外泌體重新分布的潛在意義仍有待探索。

電荷和配體介導(dǎo)的靶向

使用**帶電的陽離子脂質(zhì)的早期脂質(zhì)納米顆粒很大，由于它們的**帶正電荷，很快就被**，并且他們通常是以肺部為靶點(diǎn)。BioNTech的研究小組減少了DOTMA/Dope mRNA LNPs中陽離子DOTMA的數(shù)量，直到由于NP比小于1的陰離子mRNA過量而導(dǎo)致凈電荷帶負(fù)電。

靜脈注射這些帶負(fù)電荷的且長度為300 nm的mRNA LNPs可以導(dǎo)致脾臟靶向和樹突狀細(xì)胞的mRNA表達(dá)，它們能夠介導(dǎo)適應(yīng)性和I型干擾素介導(dǎo)的先天免疫機(jī)制用于**免疫**。同樣，用C12-200原型LNP生產(chǎn)脾靶向的mRNA LNP，但用小的、樹枝狀的可電離脂質(zhì)Cf-Deg-Lin代替C12-200，Cf-Deg-Lin具有四個亞油酸烷基鏈和四個氮原子，TNS pKa為5.7。LNP的這種極低的pKa將確保可電離脂質(zhì)在pH低于7之前不被質(zhì)子化，從而制備出一種包載帶負(fù)電荷的mRNA的LNP，直到內(nèi)涵體途徑晚期，并輸送到脾臟。

他們發(fā)現(xiàn)脾臟中表達(dá)mRNA的主要細(xì)胞群是B淋巴細(xì)胞，根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)分析，其中7%的B淋巴細(xì)胞表達(dá)mRNA。*近，利用三種不同的堿性(MC3、C12-200或5A2-SC8)作為可電離脂質(zhì)，混合在一定摩爾分?jǐn)?shù)的**性陽離子脂質(zhì)(DOTAP)或**性陰離子脂質(zhì)(18PA)中，使LNPs具有凈正電荷、凈負(fù)電荷或凈中性電荷，從而實(shí)現(xiàn)了荷電靶向。與上述發(fā)現(xiàn)一致的是，高度正電的LNPs靶向肺部，高度負(fù)電的LNPs靶向脾臟，而中等電荷的LNPs主要靶向肝臟。肝靶向已被證明取決于Apo-E與近中性脂質(zhì)體或LNPs結(jié)合，負(fù)電荷的脂質(zhì)體這樣不會產(chǎn)**生這種情況。

脂質(zhì)納米顆粒的佐劑性

已知脂質(zhì)納米顆粒具有其自身的佐劑活性。一項研究顯示，與滅活病毒相比，對小鼠給藥10 µg和對非人的類靈長類動物給藥的100 µg的核苷修飾的編碼各種免疫原的mRNA LNPs(來自Acuitas)后，濾泡輔助T細(xì)胞(Tfh)和**中心B(GC B)細(xì)胞數(shù)量增加。Tfh細(xì)胞導(dǎo)致免疫球蛋白類別的轉(zhuǎn)換、親和力成熟、以及分化生成長期的記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞。當(dāng)Fluc mRNA LNP與蛋白質(zhì)亞單位HA免疫原聯(lián)合使用時，發(fā)現(xiàn)LNP本身具有佐劑特性，**中心B細(xì)胞數(shù)量增加了4倍，盡管Tfh細(xì)胞數(shù)量與單獨(dú)使用蛋白質(zhì)相比并沒有增加。

因此LNP，特別是對核苷修飾的mRNA LNP似乎增強(qiáng)了GC B細(xì)胞的反應(yīng)。另一項研究使用默克公司的不對稱可電離脂質(zhì)，研究了LNP作為乙肝蛋白亞單位疫苗佐劑的使用。LNPs與蛋白質(zhì)亞單位疫苗聯(lián)合注射可將B細(xì)胞反應(yīng)提高到與已知疫苗佐劑類似的水平，包括鋁基佐劑、寡核苷酸和TLR4激動劑3-O-脫脂單磷酰脂A(MPL)。LNP引起了強(qiáng)有效的的抗原特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，而在LNP中加入額外佐劑可能會進(jìn)一步影響Th1與Th2的偏向。該小組使用登革病毒免疫原進(jìn)行后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，在LNP中也有類似的強(qiáng)佐劑活性，而且這種活性依賴于可電離脂質(zhì)的存在。脂質(zhì)體中的脂質(zhì)成分以前也被認(rèn)為在粘膜疫苗中具有佐劑活性。

結(jié)論

在過去的二十年里，mRNA**方法取得了非同尋常的進(jìn)展，首先是確定了利用修飾的核苷和序列工程控制mRNA先天免疫原性的方法，以及mRNA在疫苗和其他**適應(yīng)癥中的應(yīng)用。與以前的遞送系統(tǒng)相比，使用siRNA遞送的脂質(zhì)納米顆粒原型使遞送效率提高了一個數(shù)量級，并且仍在不斷提高，這主要是歸功于新型可電離脂質(zhì)的設(shè)計。mRNA LNP的結(jié)構(gòu)、功能、效價、靶向性和生物學(xué)特性(如佐劑性)的許多方面仍有待探索，以便充分發(fā)揮這種強(qiáng)大的、具有變革意義的**方式的潛力。